Die Übertragung ist einer der wichtigsten Prozesse in der Molekularbiologie. Es ermöglicht Ihnen, genetische Informationen, die in DNA codiert sind, in Polypeptidketten von Proteinen zu übersetzen. Bevor Sie jedoch mit der Übertragung beginnen, müssen Sie eine Transkription durchführen, dh eine Kopie der genetischen Informationen in Form von RNA - Ribonukleinsäure erstellen.
Die Hauptart der an der Übertragung beteiligten RNA ist die Transport-RNA (tRNA). Es ist in der Lage, an bestimmte Aminosäurereste zu binden und sie an die Ribosomen zu liefern - die Stellen der Proteinsynthese. Außerdem enthält tRNA ein Anticodon, das die Nukleotidsequenz bestimmt, die das DNA-Codon ergänzt.
Der Prozess des Aufbaus von tRNA entlang der DNA-Kette umfasst mehrere Schritte. Zuerst müssen Sie den Standort des Gens auf der DNA der Kette bestimmen und mit der Transkription beginnen, indem Sie das mRNA-Molekül synthetisieren. Das mRNA-Molekül wird dann zu den Ribosomen geleitet, wo Aminosäuren nach dem Prinzip der Komplementarität von Anticodon und Codon zu mRNA mit tRNA gekoppelt werden.
Die DNA der Kette erhalten
Um eine dreifach spiralförmige DNA-Struktur zu konstruieren, ist es notwendig, eine entsprechende DNA-Kette zu erhalten. Der Prozess der Gewinnung von Ketten-DNA basiert auf der Replikation oder dem Kopieren vorhandener Ketten-DNA.
In Vivo erfolgt die Replikation innerhalb der Zelle während der Teilung, jedoch kann es erforderlich sein, dass die DNA-Kette für die Forschung im Labor selbst hergestellt wird. Dazu sind die folgenden Komponenten erforderlich:
| Komponente | Die Beschreibung | Funktion |
|---|---|---|
| Matrix-DNA-Kette | Ein einsträngiges DNA-Molekül, das eine Sequenz enthält, in der die Synthese einer neuen Kette durchgeführt wird | Dient als Vorlage für die Synthese einer komplementären Kette |
| anwendung von Klemmenzymen | Spezielle Enzyme, die in der Lage sind, bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und an sie zu binden | Ermöglicht es Ihnen, die DNA-Matrix an den gewünschten Stellen zu halten und zu fixieren, um sicherzustellen, dass die Kette genau erkannt und synthetisiert wird |
| Nukleotide | Moleküle, bestehend aus Stickstoffbasis, Phosphat und fünfeckigem Desoxyribosezucker | Die Bausteine, aus denen eine neue DNA-Kette synthetisiert wird |
| DNA-Polymerase | Ein Enzym, das den Prozess der DNA-Synthese katalysieren kann, wenn Nukleotide in komplementären Positionen zur Matrix hinzugefügt werden | Ermöglicht die Synthese neuer DNA-Ketten und die Bindung von Nukleotiden in der richtigen Reihenfolge |
Die DNA-Synthese der Kette wird als Stufen normalerweise durch einen Algorithmus durchgeführt:
- Vorbereitung der Matrix-DNA-Kette und Anwendung von Klemmenzymen, um sie zu fixieren.
- Vorbereitung einer Reaktionsmischung, die Nukleotide, DNA-Polymerase und andere notwendige Komponenten enthält.
- Zugabe eines Reaktionsmischens zu einer festen DNA-Matrix und Inkubation bei einer bestimmten Temperatur.
- Das Reaktionsgemisch und die feste DNA-Kette bieten Bedingungen für die Synthese neuer DNA-Ketten.
- Durchführung der thermischen Denaturierungsphase, um die synthetisierte DNA-Kette von der Matrix zu trennen.
- Reinigung der synthetisierten DNA-Kette von Rückständen des Reaktionsmischens, Enzymen und anderen Komponenten.
Daher ist die Gewinnung der DNA der Kette ein wichtiger Schritt beim Aufbau von Trna entlang der DNA der Kette und kann unter Laborbedingungen unter Einhaltung bestimmter Protokolle und Verwendung der erforderlichen Komponenten durchgeführt werden.
DNA-Isolierung aus Zellmaterial
Es gibt verschiedene Methoden zur DNA-Isolierung, einschließlich Phenol-Chloroform-Extraktion, Säulenchromatographie und der Verwendung von kommerziellen Walen. Eine der häufigsten Methoden ist die Phenol-Chloroform-Extraktion.
Der Prozess der Phenol-Chloroform-DNA-Extraktion umfasst mehrere Schritte. Zuerst werden Zellen oder Gewebe einer Zerstörung oder Lyse unterzogen, um DNA freizusetzen. Die resultierende Mischung wird dann mit Phenol und Chloroform behandelt, die helfen, Proteine und Lipide zu entfernen.
Danach wird die DNA abgeschieden, normalerweise unter Verwendung von Ethylalkohol oder Isopropanol. Der resultierende DNA-Sediment kann in einem speziellen Puffer aufgelöst und für weitere Manipulationen wie PCR oder Sequenzierung verwendet werden.
Bei der DNA-Isolierung müssen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden, da die DNA labil sein kann und durch physikalische oder chemische Einflüsse zerstört werden kann. Dazu wird empfohlen, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten und spezielle Reagenzien und Plastikgeschirr zu verwenden, die für die Arbeit mit DNA bestimmt sind.
Vorbereitung der Reaktionsmischung
Um eine Trna entlang der DNA-Kette zu konstruieren, ist eine Transkriptionsreaktion erforderlich, bei der die DNA-Kette in die Trna-Kette kopiert wird. Dazu ist es erforderlich, eine Reaktionsmischung vorzubereiten, die alle notwendigen Komponenten für eine erfolgreiche Transkription enthält.
1. Nehmen Sie die Zusätze und Lösungen, die für die Herstellung der Reaktionsmischung benötigt werden:
- RNA-Polymerase – das Enzym, das für die Synthese der Trna-Kette verantwortlich ist
- Matrix - DNA - Muster für die Synthese von Trna-Ketten
- Puffer - bietet optimale Bedingungen für die RNA-Polymerase-Aktivität
- Nukleotide (Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil) sind die Bausteine für die Synthese einer Trna-Kette
- Ribonukleasen – Enzyme, die ungeschnittene Nukleotidketten zerstören
2. DNA-Proben für die Reaktion vorbereiten:
- Isolieren Sie die Ziel-DNA-Kette aus der Zellmatrix mithilfe von DNA-Extraktionstechniken.
- Reinigen Sie die resultierende DNA durch Reinigung und Konzentration von Verunreinigungen und Kontaminierungen.
- Bestimmen Sie die Konzentration und Qualität der DNA mithilfe von Spektrophotometrie oder Gelelektrophorese.
- Verdünnen Sie die DNA-Probe mit einem Standardpuffer auf die gewünschte Konzentration.
3. Reaktionsmischung vorbereiten:
- Mischen Sie alle notwendigen Komponenten in einem Reagenzglas: RNA-Polymerase, Puffer, Matrix-DNA, Nukleotide und Ribonukleasen. Sie sollten sich an ein bestimmtes Verhältnis jeder Komponente halten.
- Mischen Sie die Mischung gründlich mit einer Pipette oder einem speziellen Mischgerät, um eine gleichmäßige Verteilung der Komponenten zu gewährleisten.
4. Die Mischung bei optimaler Temperatur und Zeit inkubieren, um eine erfolgreiche DNA-Transkription zu ermöglichen.
Das fertige Reaktionsgemisch wird für eine Transkriptionsreaktion vorbereitet, die dazu führt, dass eine Trna-Kette entlang der DNA-Matrix synthetisiert wird. Eine kompetente Vorbereitung und das richtige Mischen der Komponenten sind wichtig, um die Transkription erfolgreich durchzuführen und eine Trna-Kette zu erhalten, die die in der DNA codierten Informationen zuverlässig widerspiegelt.
Behandlung der Reaktionsmischung mit speziellen Enzymen
Nachdem die DNA-Kette unter Laborbedingungen erhalten wurde, muss sie mit speziellen Enzymen behandelt werden, um Trna zu erhalten. Diese Behandlung ermöglicht es, die DNA für die weitere Synthese von RNA formbar zu machen. Dazu werden Enzyme wie RNA-Polymerase, RNA-Ligase und RNase verwendet.
RNA-Polymerase ist ein Enzym, das in der Lage ist, RNA basierend auf Matrix-DNA zu synthetisieren. Dieses Enzym wird dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, das an die DNA-Kette angedockt ist und beginnt, Trna basierend auf dem Transkriptionsmolekül der RNA zu synthetisieren.
RNA-Ligase ist ein Enzym, das in der Lage ist, zwei separate RNA-Moleküle zu einer einzigen Kette zu verbinden. Im Falle der Synthese von Trna vernetzt dieses Enzym die einzelnen RNA-Fragmente, die aus der Arbeit der RNA-Polymerase resultieren, zu einem einzigen TRNA-Molekül.
RNasen sind eine Gruppe von Enzymen, die in der Lage sind, die RNA-Kette zu spalten. Bei der Verarbeitung des Reaktionsmischens mit einem Trna-Enzym zerstören die RNase überschüssige RNA-Fragmente, die nicht Teil der trna sind. Dies ermöglicht eine saubere Trna, die für die spätere Verwendung bereit ist.
| Enzym | Funktion |
|---|---|
| RNA-Polymerase | Synthese von RNA basierend auf Matrix DNA |
| RNA-Ligase | Die Verbindung von zwei separaten RNA-Molekülen zu einer einzigen Kette |
| ribonukleasen | Spaltung der RNA-Kette |
DNA-Fragmentierung
| Fragmentierungsmethode | Die Beschreibung |
|---|---|
| Verwendung von Restriktasen | Restriktasen sind Enzyme, die bestimmte Nukleotidsequenzen in der DNA erkennen und an diesen Stellen schneiden können. So können DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe erhalten werden. |
| Sonic | Sonic ist der Prozess, bei dem Schallwellen verwendet werden, um DNA-Fragmente zu zerstören. Es ist besonders nützlich, um zufällige Fragmente gleicher Größe zu erhalten. |
| Chemische Fragmentierung | Bei der chemischen Fragmentierung der DNA werden Substanzen dem Molekül hinzugefügt, was zur Bildung von Brüchen in der Kette führt. Dies ermöglicht es, DNA-Fragmente verschiedener Längen zu erhalten. |
Nach der Fragmentierung der DNA können Sie mit weiteren Schritten zum Aufbau von TRNA fortfahren, z. B. Reverse Transkription, Klonen und Sequenzierung von DNA-Fragmenten.
Reinigung und Konzentration von DNA-Fragmenten
Nach der Fragmentierung der DNA ist es notwendig, die resultierenden Fragmente zu reinigen und zu konzentrieren, um später Trna aufzubauen. Die gereinigten DNA-Fragmente liefern genauere und zuverlässigere Analyseergebnisse.
Eine gängige Methode zur Reinigung von DNA ist die Phenol-chloroforme Extraktion. Dazu wird eine Mischung aus DNA und Phenol/Chloroform gemischt und dann zentrifugiert. Als Ergebnis dieses Verfahrens geht die DNA in die organische Phase über, während die Verunreinigungen in der wässrigen Phase verbleiben. Danach wird die DNA aus der organischen Phase extrahiert und durchläuft zusätzliche Reinigungsschritte wie Alkoholspülung und Kühlung.
Die Konzentration der DNA-Fragmente ist wichtig für eine erfolgreiche weitere Amplifikation und nachfolgende Sequenzierung. Dazu wird die Spektrophotometrie verwendet, um die optische Dichte der Probe und die DNA-Konzentration zu bestimmen. Saubere und konzentrierte DNA-Fragmente sind für weitere Phasen des Trna-Aufbaus und der weiteren Analyse bereit.
Aufbau von Trna entlang der DNA-Kette
Die Konstruktion von Trna entlang der DNA-Kette erfolgt in mehreren Phasen:
1. Transkription: ein Prozess, bei dem die DNA in zwei getrennte Ketten unterteilt wird und an einem von ihnen die RNA-Synthese beginnt.
2. RNA-Modifikation: Die Transport-RNA durchläuft einen Modifizierungsprozess und wird auf die Bindung an Aminosäuren vorbereitet.
3. Dampfende Bindung: tRNA bindet an eine bestimmte Aminosäure und bildet einen Komplex, der zur Verwendung in der Übertragung bereit ist.
4. Aminosäure-Transfer: Der tRNA-Komplex- Die Aminosäure wird auf das Ribosom übertragen, um die Polypeptidkette zusammenzubauen.
5. Termination und Freigabe: der Prozess der Trna-Synthese ist abgeschlossen, wenn das Ribosom den Stoppcode erreicht und die Polypeptidkette sich löst.
Der Aufbau von Trna über die DNA einer Kette ist ein komplexer und Mehrkomponenten-Prozess, der die Wechselwirkung vieler Proteine und RNA erfordert. Aufgrund der genauen Sequenz von Nukleotiden in der DNA kann Trna jedoch mit hoher Genauigkeit und Spezifität für jede Aminosäure konstruiert werden.
